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正文翻译：高致病性冠状病毒N蛋白通过MASP-2介导的补体过度激活加重肺损伤
小舒 舒泰神 2020-04-01

2020年3月30日，医学预印本期刊MedRxiv在线发表了揭示冠状病毒致病是由于N蛋白过度激活补体系统所致，及基于此开发的抗补体C5a疗法用于2019新冠肺炎临床研究初步结果的研究文章，题目为“Highlypathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over-activation"。

正文翻译如下：

高致病性冠状病毒N蛋白通过MASP-2介导的补体过度激活加重肺损伤

摘要
过度的免疫应答是SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2致病和致死的主要原因，但是其作用机制目前仍不清楚。本研究发现SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2 N蛋白能够和补体激活凝集素途径中关键丝氨酸蛋白酶MASP-2发生相互作用，导致补体过度活化和炎性肺损伤恶化。在体内和体外实验中，阻断N蛋白和MASP-2的结合或抑制补体的活化均能够显著减轻N蛋白诱导的补体过度激活和肺部损伤。在COVID-19病人体内可以检测到补体过度激活，应用抗-C5a单克隆抗体治疗病情恶化的患者显现出良好的疗效。抑制补体可能代表了治疗这类高致病性冠状病毒所致肺炎的一种通用方案。

一句话概要
补体激活的凝集素途径是治疗高致病性冠状病毒所致肺炎的一个有前景的药物靶标。

正文

2002 年11月中国广东报道了首例严重急性呼吸综合征（SARS），这是一种具有高传染性和高致死率的呼吸道疾病。严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）被认定为该病的病原体。在SARS爆发将近十年后，一种新的人畜共患冠状病毒，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）, 被认定是中东呼吸综合征的病因。最近，一种新的冠状病毒，SARS- CoV-2首先在中国武汉被鉴定出来，并迅速在中国其他省份和世界各地被发现。截止2020年3月20日，SARS-CoV-2已经感染23万人，致死率达到4.2%
(https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports)。该病毒的感染会引起与SARS-CoV感染类似的严重非典型肺炎。尽管这些疾病的发病机制正在被广泛研究，但仍不清楚为什么病毒感染会导致伴高致死率的呼吸衰竭。SARS- CoV核衣壳蛋白（N）是一个分子量约为46kDa的病毒RNA结合蛋白，其与高致病性冠状病毒的N蛋白同源性更高，经BLASTP比对后与SARS-CoV-2的同源性为91%，与MERS-CoV同源性为51%，而与其他已知冠状病毒N蛋白同源性为20-30%。N蛋白是SARS-CoV病毒感染后患者血清中含量最高的病毒结构蛋白之一。通过重组痘苗病毒或委内瑞拉马脑炎病毒复制子颗粒预先给予N蛋白而非其他病毒蛋白，会导致SARS-CoV感染的老年小鼠重症肺炎，表明N蛋白在病毒致病机制中可能发挥重要作用。

补体系统作为机体的免疫监视系统，能够对感染作出快速反应。补体系统的激活会导致病原物的清除和急慢性炎症。然而补体活化失控被证明与高致病性病毒引起的急性肺部疾病进展有关。补体系统可通过三条途径被激活：经典途径（classical pathway ,CP），凝集素途径(lectin pathway,LP)和替代途径(alternative pathway, AP)。在凝集素途径中，甘露糖结合凝集素（MBL）与病毒表面或病毒感染细胞表面甘露聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖残基的碳水化合物阵列结合，从而激活MBL相关的丝氨酸蛋白酶-2（MASP-2），MASP-2是唯一已知的能直接启动补体级联反应的MBL相关蛋白酶。MBL在体外以剂量依赖、钙依赖和甘露聚糖抑制的方式与SARS-CoV感染的细胞相结合，在SARS冠状病毒感染过程中增强补体C4的沉积。SARS冠状病毒spike（S）蛋白的N糖基化位点N330是与MBL特异性相互作用的关键位点。尽管在SARS患者体内发现了高水平的补体C3和C4片段，表明补体途径被激活，但是SARS-CoV诱导补体活化的机制尚不清楚，同样也不清楚SARS-CoV-2感染是否有类似的致病机制。

在此之前，我们证明了N蛋白与许多宿主蛋白具有相互作用，其中包括MASP-2蛋白的可变剪接产物MAP19。因此，本研究对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2 N蛋白与MASP-2的相互作用进行了深入的研究，并阐明了这些相互作用对宿主免疫和炎症的病理作用，为当前利用免疫调节疗法治疗COVID-19提供了机制支持。

结果
SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2 N蛋白能够和MSAP-2相互作用

为了研究SARS-CoV N蛋白与MASP-2的结合情况，并定位这两种蛋白的相互作用结构域，首先将表达携带Flag标签的MASP-2全长蛋白，或N端CUB1-EGF-CUB2区、C端CCP1-CCP1-SP区的截短突变体(图S1A)的293T细胞裂解物用抗Flag抗体交联的琼脂糖珠子进行免疫共沉淀。接着在2 mM CaCl2或1mM EDTA条件下，免疫沉淀物再与表达GFP标签的SARS冠状病毒N蛋白（GFP-SARS-N）的293T细胞裂解物或截短突变体进行孵育，并用抗Flag或抗GFP抗体通过免疫印迹法检测沉淀复合物。结果表明Flag-MASP-2和GFP-SARS-N之间的相互作用仅在CaCl2存在条件下才能发生（图1A），这符合Ca2+是MASP-2-MBL结合和MASP-2自激活的必要条件。MASP-2的CCP1-CCP2-SP区域（图1A）和SARSN蛋白的N末端结构域（1-175）对这种相互作用至关重要（图S1A和图S1B），阴性对照或其他截短突变体不发生结合，同时GFP标记的N蛋白全长或截短体没有与小鼠IgG交联琼脂糖珠发生免疫共沉淀（图 1A 和图S1B）。

（图1）

（图S1）
SARS-CoV N蛋白最早在病人出现症状后的第1天在血清中即可检测到。为模拟SARS-CoV N蛋白在血清中的结合，将Flag标记的N蛋白（1ng/ml）加入到人或小鼠血清中，用抗Flag抗体交联琼脂糖珠沉淀，发现Flag-SARS-CoV N蛋白能够与人和小鼠血清中的MASP-2结合（图1B）。进一步的截短和缺失突变体分析表明，位于SARS-CoV N蛋白（115-130）的螺旋基序中的116-124氨基酸残基是其与MASP-2相互作用所必需的（图S1C），但是并不影响MASP-2与SARS-CoVN 321-323缺失突变体（一种不能形成N蛋白二聚体的突变体）的相互作用（图1C）。

SARS-CoV N蛋白与MASP-2相互作用的关键基序（残基116-124）与SARS-CoV-2 N蛋白（115-123）和MERS-CoV N蛋白（104-112）的相应基序高度一致（图S1D），表明SARS-CoV2和MERS-CoV的N蛋白也可能与MASP-2具有相互作用。正如预期，外源表达的MERS-CoV和SARS-CoV-2N蛋白均与MASP-2能够结合（图1D和1E），并且MERS-CoV N蛋白104-112缺失突变体显示出与预测相符的结合减弱（图1D）。因此，结果表明冠状病毒N蛋白中的一个保守基序对于与MASP-2结合至关重要。

SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白增强MASP-2依赖性补体激活

MASP-2的CCP1-CCP2-SP结构域负责其自激活和底物结合活性，进而介导补体凝集素途径活化。上述MASP-2:SARS-CoV N蛋白的相互作用表明，N蛋白可能调节MASP-2的活化，以及二聚化形成所需的水解。为了证明MASP-2:MASP-2二聚体的形成，在有或没有N蛋白和MBL的情况下，Flag标签的MASP-2交联琼脂糖珠与表达Myc标签的MASP-2的293T细胞裂解物进行孵育。在近似等摩尔化学计量下，SARS-CoV N蛋白增强了MASP-2-Myc与MASP-2-Flag的结合（图2A）。接下来，纯化的MASP-2-Flag分别与甘露聚糖和MBL（含或不含SARS-CoV N蛋白）进行孵育。在SARS冠状病毒N蛋白存在下，MASP-2自激活并产生较高水平的MASP-2片段（445-686）（图2B）。

(图2）

（图S2）

为了研究SARS-CoV N蛋白对MASP-2和MBL结合能力的影响，纯化的MBL和MASP-2在以避免MASP-2活化的4℃条件下与甘露聚糖包被微孔板进行孵育，并用抗MASP-2抗体评估MASP-2:MBL结合的动力学。与作为N蛋白阴性对照的结合缓冲液中高浓度组分人血清白蛋白（HSA）相比，在MASP-2相对低浓度（1%～0.1%）和Ca2+存在下，MASP-2与MBL的结合明显增强，抗N蛋白抗体能够有效地逆转了这种增强趋势（图2C）。此外，与全长SARS-CoV N蛋白相比，SARS-CoV N蛋白 116-124或 321-323截短突变体或致病性较低的人冠状病毒229E-CoV N蛋白对MASP-2:MBL结合几乎没有影响（图2C）。这些结果表明SARS-CoV N蛋白增强的MASP-2自激活不仅依赖于MASP-2的结合，而且还依赖于N蛋白的二聚化。

补体系统被激活后，凝集素途径中MASP-2切割补体成分C2和C4生成C3转化酶。进一步，我们用C4裂解法研究SARS-CoV N蛋白对凝集素途径补体激活的影响。在反应体系中有或没有等摩尔N蛋白的情况下，纯化的C4与MASP-2、甘露聚糖、MBL进行孵育，可以发现在甘露聚糖和MBL存在的情况下，SARS-CoV N蛋白显著增强C4裂解（图2D和图S2A），同样SARS-CoVN蛋白（116-124和 321-323）截短突变株以及H229E-CoV N蛋白不能促进MASP-2介导的C4水解（图2E和图S2B）。值得注意的是，抗MASP-2单克隆抗体或MASP-2抑制剂C1INH能够阻断SARS-CoV增强C4水解，提示N蛋白增强C4水解是依赖于MASP-2的激活（图2E和图S2B）。此外，我们还发现MERS-CoVN蛋白也能够增强C4的水解（图S2C）。这些结果表明，N蛋白通过MASP-2相互作用和激活促进C4水解，进而激活补体。

通过补体沉积实验进一步研究了SARS-CoVN蛋白通过凝集素途径对补体激活的影响。纯化的C4在N蛋白存在下与固化的MBL-MASP-2复合物进行孵育。除了H229E-CoV的N蛋白，SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV2的N蛋白，以剂量依赖的方式增强了依赖于MASP-2活性的C4b沉积（图2F、图2G和图2H）。之后，将固化的甘露聚糖与C1q缺失血清（排除经典途径）在SARS-CoV N蛋白存在与否的情况下进行孵育，并用activated-C3 抗体特异性检测C3 活化片断（C3b、iC3b和C3dg）的沉积。与C4b沉积相一致，随着SARS-CoV N蛋白水平的升高，C3活化片段的沉积明显增加，高达40nM（图S2D），这表明C3转化酶活性增强。此外，SARS-CoV N蛋白对含EGTA无钙缓冲液中活化的C3沉积几乎没有影响，这表明SARS-CoV N蛋白增强的C3活化是通过凝集素途径（LP）而不是替代途径（AP）发生的，这是因为在替代途径中C3的活化与Ca2+无关（图S2E）。在高浓度N蛋白存在下（图S2D和S2E），C3b沉积减少，可能是由于当表面被高密度C3b覆盖时，血清中的可溶性抑制剂（如Factor H和Factor I）导致C3b被进一步水解所致。我们进一步分析了C5b-9复合物的沉积。作为补体级联放大的结果，SARS-CoV N蛋白在一个低的多浓度即可诱导复合物的沉积显著增加，这与患者血清中的观察相似（图S2F）

（图S3）

通过C3b或C5b介导的调理作用，补体激活在吞噬病原体和细胞碎片方面发挥关键作用。为了研究补体依赖性的吞噬作用，在SARS-CoV N蛋白存在与否的情况下，大肠杆菌和小鼠腹腔巨噬细胞在稀释的C1q缺失血清中共同孵育。用FITC标记的抗C3c抗体对C3或C3裂解后的大片段C3b进行染色，显微镜下计数含C3结合大肠杆菌的FITC阳性巨噬细胞。与补体激活相一致，与HSA对照组相比，SARS-CoV N蛋白增强了小鼠腹腔巨噬细胞在含有补体成分（包括MASP-2）的人血清中的补体依赖性吞噬作用（图S2G）。这些发现表明SARS-CoV N蛋白通过一种非经典途径有效地促进了补体系统的激活和调理作用。

SARS-CoV 和MERS-CoV N蛋白通过MASP-2
参与的补体激活使得LPS诱导的肺炎恶化

补体持续激活导致不受控的炎症。为了研究N蛋白启动的MASP-2激活在炎症中的作用，小鼠被1109PFU腺病毒预先感染，其中分为表达SARS-CoV N 蛋白的腺病毒(Ad-SARS N)、表达N蛋白突变体的腺病毒或空载体的腺病毒(Ad-null)。然后小鼠被用含有MBL结合结构域的LPS诱导激活LP途径并诱发炎症。用5 mg/kg LPS 诱导时，预感染空腺病毒载体的10只小鼠中有8只存活（图3A），而预先感染Ad-SARSN 的10只小鼠在被同样剂量的LPS诱导时在12h内全部死亡（图3A）。在死亡小鼠中发现了严重的肺损伤和大量的炎性细胞浸润（图3B）。与前期发现一致，预感染表达229E 突变的N蛋白或D116-124或 D321-323 N蛋白的腺病毒时，小鼠致死率显著下降。在给予预感染Ad-SARS N 小鼠LPS刺激的同时，如果给予抗MASP-2抗体或C1INH， LPS诱导的小鼠死亡率和肺组织炎症反应均显著下降（图3A和图3B）。这些结果共同提示，SARS-CoVN 通过激活MASP-2进而启动LP参与的补体反应，显著加强了LPS诱导的炎症。

（图3）
为了研究LPS和N蛋白诱导的补体激活，小鼠被Ad-SARS N (1108PFU) 预感染后，用LPS (5 mg/kg)进行刺激。给予LPS后6hr, 小鼠被处死，多聚甲醛固定的肺部组织被用anti-C4b 抗体染色后进行免疫组化分析或用FITC标记的anti-C3c抗体进行免疫荧光分析。与LPS和Ad -null处理小鼠肺部的弱染色相比（图3C和图 S3A中间）， LPS 和 Ad- SARS N 预处理的小鼠肺部C4b和激活的C3沉积显著增加（图3C和图3D中间）。

MASP-2 和 N protein在体内的结合情况被进一步利用抗N蛋白抗体和抗MASP-2抗体进行了原位临位连接分析（图3D左侧和图S3A），只有当SARS-CoV N 和 MASP-2相互结合时才能检测到的红色信号，在表达SARS-CoV N的小鼠肺部被大量检测到，而阴性对照小鼠中没有检测到。这些结果确认了MASP-2 在小鼠肺部组织与SARS-CoV N原位直接结合并被后者激活。

类似地，被预感染表达MERS-CoV N蛋白的腺病毒(Ad-MERS N)后再用LPS刺激的小鼠，表现出严重的肺炎并且在24h内100%死亡，而预感染表达 104-112突变N蛋白腺病毒 (Ad-MERS N104-112)的小鼠则没有，这一致死表型可以被C1INH和 anti-MASP-2抗体部分挽救（图3E）。这些结果提示SARS-CoV和MERS-CoV均利用N蛋白通过MASP-2介导的凝集素通路促进补体激活。

N蛋白的致病性被利用MASP-2敲除后缺乏MASP-2蛋白酶活性的小鼠用同样的方式进行了研究（敲除区域见图 S3B）。小鼠被Ad-SARS N或Ad-MERS N (1108PFU) 预感染5天后用LPS刺激。与野生型小鼠相比，MASP-2敲除小鼠存活时间更长，存活率更高（图3F），这可能是由于MASP-2缺失后补体激活被抑制所致。

COVID-19患者肺部补体系统过度激活

由于SARS-CoV and SARS CoV 2在小鼠中仅诱发温和的肺部损伤，而在小鼠中研究活的SARS-CoV或鼠SARS-CoV并不被监管许可，我们尝试在COVID-19患者中获得补体LP通路过度激活的证据。收集死于COVID-19的患者肺部组织用多聚甲醛固定后，用MBL, MASP-2, C4a,C3 或C5b-9抗体染色进行了免疫组化分析。这些补体组分均在患者肺部组织显示强阳性染色（图4A-E），表明补体组分在I型、II型肺泡上皮细胞中沉积，炎性细胞、增生性肺细胞也是如此，还在肺泡间隙发现了渗出物和坏死细胞碎片。值得注意的是，通过尸检在死者的肺部组织中发现了SARS-CoV-2的N蛋白。进一步地，在COVID-19患者中观察到了血清中C5a水平的显著增高，特别是在重型患者中（图4F）。这些结果共同提示，在COVID-19患者肺部补体系统被过度激活，而这可能是由SARS-CoV-2病毒的N蛋白诱发的。

（图4）

补体靶向疗法对2019新冠肺炎显现出积极的治疗效果

过度的炎症反应和细胞因子风暴是2019新冠肺炎重症化和致死的重要原因，这一观点已被广泛接受，而这可能要归因于补体通路的不受限激活。因此，下调MASP-2及其下游信号分子，如强力的过敏毒素C5a，可能提供了一种控制SARS-CoV-2所致肺炎的新手段。

基于我们的发现和其在2019新冠肺炎治疗中的潜在的、有吸引力的应用前景，一种重组抗C5a抗体（BDB-001注射液，舒泰神（北京）生物制药股份有限公司研发，正在开展用于化脓性汗腺炎治疗的I期临床试验），被国家药品监督管理局迅速批准用于2019新冠肺炎治疗（临床批件号2020Lhk00003）。一项“在2019新冠肺炎普通型患者中的多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床研究”和一项开放性“重型、危重型2019新冠肺炎患者的两队列临床研究”在获得武汉火神山医院伦理委员会批准和得到患者知情同意后展开。在此我们将报告在开发性试验中最先给予抗C5a抗体治疗的两例患者的相关结果，试验结束后来源于更多患者的更多数据将另行报道。

第1例患者，54岁、男性、武汉市民，出现发烧症状后第4天（发病5天）被东西湖医院收治。通过rRT-PCR确诊SARS-CoV-2感染，胸部CT显示双肺不透光影。病情从发病第9天开始恶化，高热（38.7C〜39.8C），呼吸室内空气SpO2<93％，CT显示肺炎进展，严重肝损伤。在发病第10天至13天服用泼尼松（40mg/天，共4天），但病情恶化，所以患者在发病第14天被转移到应急成立的收治重症COVID-19患者的武汉火神山医院（图5A），并被诊断为高危重型患者，伴中度ARDS（氧合指数<150），呼吸频率30次/分，呼吸室内空气1分钟后指氧饱和度（SpO2）降至77％。给予支持治疗，经鼻高流量氧疗（HFNO）血氧饱和度可达到SpO2>95％（图5B，左侧），并给予抗生素（莫西沙星）和人血清白蛋白治疗，停用泼尼松。在发病第15天早晨给予抗C5a单克隆抗体（BDB-001）治疗，300mg/d，溶于250ml 0.9%氯化钠溶液，在第1、2、3、5、7、9、11和13天分别静脉输注。给药后未观察到不良事件，首次给药同天晚上体温恢复正常（图5C，左侧），临床状况逐步改善，氧合指数（PaO2/ FiO2）（图5B，左侧）和淋巴细胞数量（图5C，左侧）增加，C反应蛋白（CRP）浓度降低（图5C，左侧），肝功能明显改善（ALT、AST降低，总血清蛋白、血清白蛋白浓度增加，图5D，左侧）。达到SpO2>95％时，FiO2和经鼻高流量氧疗（HFNO）的氧流量从最高（80％、40L/min）最终降至30％、20L/min（图5B，左侧）。由于在临时建立的医院内对患者进行CT检查的高风险性（没有高流量氧疗条件下，低温阴雨天气，长距离转移）在给予C5a治疗前不具备CT评价的条件。然而，肺炎症状在首次给药20天后较首次给药11天时观察到了显著改善（图S4上方）。

（图5）

（图S4）

第2例患者， 67岁、男性，出现发烧和咳嗽症状后的第5天（发病6天）被送进第六医院， CT显示左肺上叶不透光影（图S5A）。在发病第11天，通过rRT-PCR确诊SARS-CoV-2感染。给予抗病毒药（阿比多尔）、抗生素（莫西沙星）和其他支持疗法。第8天病情恶化，伴有严重咳嗽和高热（39.7C）（图5C，右侧）。给予甲泼尼龙（40mg /天，从发病第8天起连续使用7天）后症状几乎没有改善。患者在第10天转入武汉火神山医院（图5A），病情继续恶化，表现为呼吸室内空气SpO2<90％（第14天），高热（第10-13天高于39C）（图5C，右侧），第11天胸部CT显示肺炎（首次给药前2天）（图S4，下方），患者报告有咳嗽、胸闷、呼吸困难。给予HFNO维持SpO2>95%。在发病第14天早晨给予抗C5a治疗，治疗方法同第1例患者。随后，在同一天体温恢复正常（图5C，右侧）。第二天（发病第15天）咳嗽、呼吸困难和胸部压迫感减轻。随后观察到C反应蛋白（CRP）水平显著降低，白细胞和淋巴细胞数量显著升高（图5C，右侧），肝功能逐渐改善（图5D，右侧，第15天的数据未收集到）。维持SpO2>95%所需的氧疗流速和流量逐步降低，SpO2/FiO2持续升高（图5B, 右侧）。第26天胸部CT也显示肺炎减轻（图S4 ,下侧）。

这些数据首次提供了在COVID-19重症患者中C5a具有破坏作用的证据。两例重症患者在抗C5a抗体疗法中显著获益，提示异常的补体系统是治疗COVID-19的良好靶标。

讨论：

过去17年间，SARS、MERS、SARS-CoV-2打破物种屏障侵袭人类，带来了新的传染性疾病和社会恐慌。这些高致病性冠状病毒均可造成急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征（ARDS），进而导致重症化和致死率上升。病毒感染者可由严重免疫损伤进展为非典型性肺炎。过度激活的免疫反应以剧烈释放促进炎症的细胞因子和趋化因子为特征，这被称为“细胞因子风暴”，并被认为是包括SARS-CoV-2在内的高致病性病毒导致严重肺炎的主要原因。尽管免疫致病机理已经在SARS和MERS中得到部分揭示，对于病毒诱导的宿主免疫系统过度激活的机制仍然知之甚少。

在此我们展示了SARS、MERS、SARS-CoV-2具有一种共同的致病机制，通过病毒N蛋白结合并启动MBL、钙离子依赖的MASP-2自激活，导致补体系统的不受控激活，表现为C4切割增强和补体沉积（图1、2）。N蛋白与MASP-2的结合放大了MASP-2介导的凝集素通路激活。不能结合MASP-2或不能形成二聚体的N蛋白突变体均对MASP-2介导的凝集素途径无影响（图1C、D），表明N蛋白的作用依赖于其与MASP-2的结合和自身的二聚化。

作为一柄“双刃剑”，补体系统对于天然免疫系统对抗病原物非常重要。过敏毒素，如C3a和C5a，可以激活免疫细胞并因此诱导多种细胞因子释放。激活的补体系统产生溶细胞末端补体复合体C5b-9、C3b和C5b片段。这些多肽诱导花生四烯酸代谢物合成，包括prostaglandin (PG) E2, thromboxane B2 和 leukotrienes，进一步招募并激活中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞，并刺激一系列促炎性细胞因子的产生。这些细胞因子引发并维持炎症过程并帮助天然免疫系统对抗病毒。然而，补体参与天然免疫系统的激活必须被严格控制，因为不受控的补体激活会导致弥漫性血管内出血（DIC）、炎症反应、细胞死亡、免疫瘫痪并最终导致多器官衰竭和死亡。冠状病毒N蛋白增强补体激活的发现，提供了一个新的理解SARS-CoV, MERS-CoV和SARS-CoV-2 感染导致肺炎的视角。此外，我们也注意到预先感染Ad-SARS N或者AD-MERS N 显著增加了LPS诱发肺炎的致死率（图3），提示在继发性细胞感染释放大量LPS后诱发的炎症损伤中N蛋白的潜在作用。

N蛋白介导的MASP-2激活及后续的补体过度激活在冠状病毒致病过程中的作用，提供了一种开发对抗SARS、MERS和最新的COVID-19的新策略，示意图如图6所示。

（图6）

首先，利用抗体中和血清中的N蛋白可有效减轻LPS/Ad-SARS N 或LPS/Ad-MERS N 刺激后小鼠的肺损伤和死亡率。相一致的，具有针对高低度的N蛋白特异性抗体而非spike蛋白特异性抗体的SARS患者恢复更快，表明抗N蛋白抗体滴度与SARS患者预后相关。根据我们的发现，在MERS和SARS-CoV-2感染中可能具有相同的机制。

第二，MASP-2敲除小鼠在Ad-N/LPS诱发的肺炎模型中表现出更温和的症状和更短的病程，确认了MASP-2在重症肺炎进展中时扮演了有害的角色。与此一致，给予抗MASP-2抗体或MASP-2抑制剂C1INH表现出显著的疗效（图3）。具有更高亲和力和更好中和活性的改进的MASP-2抗体，如在血栓形成性微血管病表现出明显效果的OMS721，或者注射用C1INH药物，如HAEGARDA, 可能提供有效的保护。针对SARS-CoV-2诱发的肺炎进行进一步的临床评价值得尝试。

第三，我们在死亡患者的肺部组织观察到了补体系统的过度激活，这与Ad-SARS N / LPS小鼠模型是一致的。在重型而非普通型患者的血清中存在高水平的C5a累积（图3、4）。因此，针对补体系统的免疫调节对于致病性冠状病毒相关疾病的炎症控制可能是有效的。这一通路中，C5a是诱发炎症反应的最强力的补体蛋白。阻断C5a信号已经被报道可以改善高致病性病毒导致的急性肺损伤。基于我们的科学发现及舒泰神和InflaRx（使用同一生产细胞克隆生产抗C5a单抗）在其他疾病中开展的phase II临床试验中良好的安全性数据， 舒泰神公司生产的重组抗C5a抗体被国家药品监督管理局批准开展用于重型和危重型COVID-19患者的临床试验。至少在最早的两例均处于病情恶化中的患者中，抗C5a 抗体展现出快速、有吸引力、超出临床医生预期的治疗效果。尽管最终的疗效要等到临床试验完成才能获得，但值得期待抗C5a抗体将提供一种治疗COVID-19的新手段。