mRNA疫苗产业链

国产mRNA疫苗按下加速键 哪些上游环节受益？[淘股吧]

2022-04-06 11:15·科创板日报

《科创板日报》（上海，编辑 宋子乔）讯，国内mRNA疫苗正加速推进产业化进程。近日，石药集团、康希诺相继宣布其新冠病毒mRNA疫苗临床试验获批。

此前，进入临床试验阶段的还有沃森生物、艾博生物、斯微生物、艾美疫苗等企业。其中斯微生物正加速研发新冠mRNA迭代疫苗，该产品正在老挝开展2期临床试验，公司已在上海建成4亿剂/年的新冠mRNA迭代疫苗生产线。

mRNA疫苗疗法是指通过将体外转录的mRNA注射到人体内，起到激活免疫应答的作用，并建立记忆细胞，进而预防免疫。具有研发周期短、抗原选择范围广、安全性高、有效性高等诸多优点。

国家卫生健康委已开始部署序贯加强免疫接种，mRNA疫苗是重要的选择之一。中国疾控中心前首席流行病学专家曾光日前表示，序贯免疫可持续性较好，2针灭活疫苗+mRNA疫苗/重组蛋白疫苗/腺病毒载体雾化吸入都是可能的选择。

后续随着国产mRNA疫苗相关产品的临床和上市进度推进，对上游供应链的需求有望不断增加。“十四五”医药工业发展规划已经明确指出，紧跟疫苗技术发展趋势，支持建设mRNA疫苗，提高疫苗供应链保障水平。国金证券、太平洋证券、德邦证券等多家机构均在近期发布研报，表示看好mRNA疫苗上游供应链的投资机会。

▍哪种原材料的价值量更高？
想要了解mRNA疫苗原料端的价值分布情况，必须要知道mRNA疫苗的生产过程：可分为制备和包封两大环节，前者包括DNA原液和mRNA原液的制备，后者指利用脂质微粒进行包封。

1．制备＞＞
制备DNA原液需要提取带有病毒的DNA质粒，该环节的工艺很成熟，大部分mRNA企业采取外包形式，在产业链中不算价值量特别大的环节。而在制备mRNA原液中用到的酶，是mRNA制备中最主要的成本，占比达到65%，且一般体外转录过程中所需要的一系列酶会由同一家酶生产企业提供。
根据太平洋证券分析师盛丽华测算，mRNA疫苗酶是最重要的原料之一，也是价值链最大的一块，预计10亿剂的mRNA疫苗将带近60-70亿元的酶相关的需求。





海外分子酶提供商主要是新英格兰实验室、赛默飞、默克，Takara，其中应用最广泛的是新英格兰实验室。转录一系列酶相关国内公司则有近岸生物、诺唯赞、翌圣生物、爱博泰克、蓝鹊生物、瀚海新酶等。


2．包封＞＞
mRNA疫苗的众多原材料中，包封环节的脂质材料的价值量仅次于酶。目前，mRNA疫苗发展受限的一大原因是递送系统，如何特异性地将mRNA递送进入靶细胞是一大难题。脂质纳米粒（Lipidnanoparticles，LNPs）是目前最先进和主流的mRNA递送系统。根据太平洋证券分析师盛丽华测算，10亿剂mRNA疫苗的LNP脂质材料的成本在20-40亿元。


细分来看，LNP的组成成分通常包括阳离子脂质、聚乙二醇（PEG）、胆固醇和磷脂四种。其中，阳离子脂质有很高的专利壁垒，国内具备小分子研发的CRO都可以承接，包括凯莱英等。键凯科技、厦门赛诺邦格则可提供PEG修饰脂质。


mRNA新冠疫苗已在海外充分证明其安全性和有效性，临床前研究结果也显示，与现有新冠疫苗相比，石药集团与康希诺开发的mRNA疫苗广谱性更强，可以更有效地保护机体免受现有变异株的感染。序贯接种方案也让mRNA新冠疫苗的关注度继续提升，国内亟需补全该技术路线。

mRNA技术全流程[淘股吧]

2021-11-23 07:00·医学顾事






mRNA，中文译名“信使核糖核酸”，是由DNA的一条链为模板转录而来。它是携带着遗传信息并能够指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
1953年，第一个DNA双螺旋结构的分子模型诞生，随着对于DNA研究的深入，科学界开始逐步明确DNA转录翻译为蛋白质的过程：首先DNA转录成为mRNA，其后mRNA指导核糖体翻译成蛋白质。可见mRNA是DNA翻译为蛋白质的关键“信使”。


1961年，科学家首次成功提取到mRNA。从这一刻起，科学家们意识到有可能发现了一种新的疾病治疗路径。




在科学家的畅想中，以mRNA为核心的治疗路径大致有四步：

首先，筛选并获得疾病相关的关键mRNA，靶点设计；
其次，让这段mRNA携带着疾病相关信息进入人体，化学修饰；
再次，mRNA精确高效指导人体免疫系统产生抗体或记忆淋巴细胞，序列优化；
最终，人体免疫系统发现并自主杀死导致疾病的细胞或病毒；

可以看出，这是在引导人体自身免疫系统治疗疾病，这与外源性药物治疗疾病的途径有着巨大差异，安全、高效几乎是它天然的标签。
此后29年的时间，科学家们不断努力，期望实现这一路径。

终于在1990年，美国威斯康星大学的科研团队有了新的突破，他们将体外通过转录提取的mRNA注射至小鼠骨骼肌内，成功转化成相应蛋白质并产生免疫反应。这一发现震惊学术界，说明存在于理论中的治疗路径有着实际操作的可能，理想成为现实的蓝图就此展开。从mRNA的治疗路径可以发现，一个有效的mRNA药物的关键是对于该药物的核心mRNA进行精心设计。为了让核心mRNA真正有效，需要进行三个方面的优化，这些优化对于mRNA技术而言起到了至关重要的作用。

01
mRNA靶点设计
mRNA疗法适用于多种的疾病，例如被经常提及的癌症治疗的各种生物药物（疫苗、细胞因子、抗体等）、感染性疾病疫苗和抗体、自身免疫病、及罕见遗传病病等领域。不同的疾病就需要针对性的选择mRNA目标基因，这也就需要关注治疗路径的第一步——获得疾病相关的mRNA ，也就是mRNA的靶点选择。
特异性的mRNA靶点选择，需要对于疾病的病理和发病机制有深入的研究，而对于靶点的选择会直接影响到mRNA药物治疗的效用。例如对于新冠疫苗,目前研发的mRNA大多集中于刺突蛋白（S蛋白），它是人体细胞受介导病毒入侵的关键蛋白，能够全面激活自体免疫反应。但是即使是这样优秀的靶点同样存在着缺陷，有研究表明目前mRNA疫苗的不良反应与刺突蛋白有着一定的关系。

02
mRNA化学修饰
我们人体有着一道道的其他防线，诸如酶降解系统、膜转运系统、组织清除效应等，它们如同一条条马奇诺防线，横亘在mRNA进入人体的征途上。然而，和这些防御工事相比，我们的免疫系统则像一位带刀护卫，警惕着外源性物质的入侵。为了顺利完成进入人体的目标，科学家逐步完成了mRNA化学修饰。
mRNA化学修饰的基础集中于改善其自身的两大劣势：脆弱及易受人体免疫系统攻击，这也是将mRNA分子中尿苷替换为假尿苷的主要目的。随着对于化学修饰的深入，在mRNA的纳米载药系统方面也在不断涌现新的化学修饰方式，例如对于脂质纳米微粒（LNPs）的化学修饰等。
mRNA携带的信息从本质上说就是蛋白质碱基对序列的信息，这些信息如同一把专属的钥匙，决定了特定蛋白质的开启。因此mRNA药物也可以称为信息药物。
对于序列优化的过程来说，大致有如下方式：去除稀有密码子，调整碱基对含量、增加mRNA稳定性并在合成中降低二级mRNA结构等


图片来源于网络


04
mRNA技术平台化对研发的重要性
通过以上三个方面优化的简介，我们可以看到，mRNA药物与传统药物研发有着巨大的差异，呈现典型的“三多”形态，涉及的领域多、研发关键点多、成功的障碍多。而在面对“三多”形态时，技术平台化是关键的应对措施。利用统一的mRNA技术平台进行开发，有利于在扩展管线、研发不同疾病的治疗或预防时从技术源头上有效的控制风险。

浅析mRNA疫苗的工艺流程[淘股吧]

丹纳赫生命科学2022.1.1472


新冠病毒的蔓延促进了mRNA技术的发展，成为2021年《麻省理工科技评论》发布的“全球十大突破性技术”名单的榜首，并指出mRNA技术在各种传染病与肿瘤等治疗方面拥有广阔的应用前景。





《麻省理工科技评论》全球十大突破性技术



目前，在Clinical Trial网站上，有大约80项有关mRNA技术的临床试验在开展，有用来制备流感疫苗、宫颈癌疫苗、非小细胞肺癌疫苗、食管癌疫苗、新冠疫苗等。随着mRNA疫苗研发管线越来越丰富，商业化产品越来越多，其生产工艺也正在逐渐趋于成熟，主要流程为：





mRNA的工艺流程


01
质粒的制备及线性化

质粒DNA主要是通过大肠杆菌的表达获得，其技术已经相当成熟，获得纯化的质粒后，用限制性内切酶对质粒进行酶切，处理成线性化双链DNA模板，作为mRNA体外转录的模板。

之前有文章报导滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）可以不用PCR，37度扩增质粒，此技术用了一个特殊的DNA聚合酶phi29，它可以自己打开DNA双链，无需PCR反应加热解双链。虽然此过程不需要细胞参与，提高了工作效率，但目前未见用于工业化。

02
mRNA的体外转录

mRNA的体外转录有两种方式：一种是以线性化质粒为模板，利用含有T7启动子或SP6启动子条件下，以NTP为底物，使用RNA聚合酶合成mRNA再进行修饰；另一种是先进行加帽、加尾及碱基类似物修饰，再利用T7 RNA聚合酶合成mRNA。





mRNA的分子结构特征
Pharmaceutics.2020 Feb;12(2):102



03
mRNA的加帽加尾

mRNA转录后或在转录过程中需要加帽加尾，主要作用是提高mRNA的翻译效率，维持mRNA的稳定性。mRNA的加帽过程主要是在mRNA 5´端第一个核苷酸上添加7 - 甲基鸟苷（m7G），可保护mRNA免于降解，增加可议性及调高剪接效率，是促进核糖体靶定到mRNA进行翻译的关键因子。帽结构共分为三类：Cap 0，Cap 1，Cap 2，目前有三种工艺路线进行加帽反应：

1）转录完成后，通过加帽酶、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）与GTP进行加帽。此方法采用酶学法，利用牛痘病毒加帽系统，使用天然帽，系统内含RNA三磷酸酶、鸟嘌呤甲基转移酶及鸟嘌呤转移酶、甲基供体SAM、GTP和反应缓冲液。此反应将Cap 0 mRNA转化为Cap 1 mRNA，反应时间较短，帽结构以正确方向进行添加，加帽效率接近100%，效率较高，但是需建立额外的酶反应体系。

2）转录过程中加入帽结构类似物。在转录反应中添加mRNA帽类结构类似物，如利用抗-反帽结构类似物（ARCA）共转录定向加帽，这种转录方式产量较低，但是反应速度快。

3）Cleancap技术，通过模仿产生天然Cap 1结构，减少模式识别受体的激活，降低对宿主先天免疫系统的刺激，解决与ARCA相关的加帽效率低或酶成本高的问题。此方式加帽效率高于94%且毒性小，技术简便，是新一代加帽技术。


mRNA的加帽技术
* 以上图片来源于网络
mRNA 3´端有一段多聚腺苷酸尾，称Poly A尾，与mRNA 5´端的5´Cap共同调解mRNA的翻译效率，长度最佳为120-150个核苷酸，过长或过短都会影响mRNA的稳定性和翻译效率，是否含有Poly A 尾也会影响翻译效率。mRNA的Poly A尾具备可以助力mRNA从核到细胞质的转运与降低mRNA受到核酶的降解，增强mRNA的稳定性等功能。mRNA加尾方式有两种：

1) 通过使用重组Poly A聚合酶进行修饰，但制备出的Poly A尾长度不同，会影响翻译效率。此方法受温度和时间影响，RNA降解快，需计算RNA与ATP的比例。

2) 通过在模板中设计编码固定长度的序列，在体外直接转录生成，此方法操作简单，可以明确Poly A尾的长度。

04
mRNA的纯化

通过反转录及酶反应获得的mRNA产物会产生截短型RNA、双链(ds)RNA、反应物等杂质，在下游的纯化工艺中需要进行去除。目前主要的mRNA纯化技术有：

1）Oligo(dT)亲和层析：通过与Poly A尾结合，进行亲和纯化，可以去除大部分NTPs、酶、DNA等杂质，但不能区分dsRNA和截短型RNA。

2）离子交换色谱IEC：通过等电点不同来做纯化，对dsRNA和截短型RNA都有一定的区分能力，一般作为精制纯化。IEC在单抗生产中已经很成熟，可以实现工艺快速放大。

3）疏水层析HIC：可以作为精制纯化步骤，进一步区分dsRNA与截短型RNA，但此方法放大有难度。

4）离子对反向色谱法：可以很好地通过疏水性来区分目标产物，分离效果佳，但是反相柱难以放大，且乙腈毒性也较大。

05
mRNA的递送

由于mRNA较大（104–106Da）且带负电，无法通过细胞膜的阴离子脂质双层，因此体内应用需要使用mRNA递送载体，该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前，有多种技术用于mRNA的递送，其中最广泛应用的是脂质纳米颗粒LNP。

LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂组成，主流的LNP制备方法是微流控混合法，将含有脂质的乙醇溶液和含有核酸的水溶液，分别注入制备系统的两条通道，在层流中两相不会立即混合，通过通道中设计的微观特征可重复地控制两相的混合，从而快速、可控、均匀的混合产生纳米颗粒。




LNP 脂质纳米颗粒

06
LNP的浓缩换液

传统的浓缩换液采用的是切向流超滤TFF技术，主要是形成循环浓缩，上游料液在浓缩过程中会承受泵、管路和超滤膜包的剪切力作用。PALL拥有Single Pass TFF技术，通过膜结构的内部改变，使料液在膜包内单向流动一次，在回流端获得浓缩后的料液，通过增加流路长度达到浓缩效果。这种技术大幅度降低了料液循环次数，并降低膜包剪切力，对剪切比较敏感的LNP、蛋白、病毒等具有保护作用。





Single Pass TFF 单向流动模式



07
mRNA生产的工艺方案

对于mRNA的整个生产工艺来说，丹纳赫生命科学拥有两种工艺路线方案。

路线一：采用一次性混合器或反应器进行质粒的线性化、体外转录、加帽加尾以及DNA降解反应，使用超滤膜包或中空纤维进行超滤浓缩，LNP浓缩换液采用PALL的Single Pass TFF技术，除菌过滤也是采用PALL的囊式滤器。此种路线适用于mRNA转化效率高、DNA降解得比较好的工艺流程。


mRNA工艺路线1


线路二：加入了层析的步骤，实现对mRNA的富集和纯化。
mRNA工艺路线2

随着越来越多的企业加入到mRNA药物的研发和生产中，选择适合自己的工艺路线，达到效率、质量和成本的相对平衡是需要考虑的重要因素，丹纳赫生命科学多样化的mRNA制备方案给用户提供了不同的选择方向。